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Nature綜述文章：Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy
多年來，細胞生物學家們一直在嘗試不同的技術(shù)來對細胞進行成像，并期望從時間和空間尺度上理解細胞行為。然而，這些成像技術(shù)的分辨率很少能夠達到足以讓人們理解其中化學反應的程度。冷凍電子顯微鏡的出現(xiàn)極大地促進了人們對細胞內(nèi)大分子功能型復合物的理解，它所能達到的超高分辨率可以為解釋細胞運作提供更加細節(jié)的化學視角。
近日，來自加州大學伯克利的Eva Nogales和來自歐洲分子生物實驗室的Julia Mahamid在Nature上發(fā)表了題為Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy的綜述。該文章主要探討了冷凍電子顯微鏡(cryo-EM, cryo-electron microscopy) 和冷凍電子斷層掃描 (cryo-ET, cryo-electron tomography) 之間的異同，以及冷凍電鏡的整體發(fā)展和其在細胞生物學中的應用。
作者首先對cryo-EM和cryo-ET的異同進行了簡要介紹。Cryo-EM的技術(shù)最早可以追溯到上世紀五六十年代，隨著幾十年來的不斷改進和發(fā)展，cryo-EM成為了解析生物大分子的強大工具。相比于X射線晶體衍射和核磁共振波譜，cryo-EM通常需要更少的樣品材料，并且對于分子的大小要求也沒有上限。與cryo-EM分離純化樣品分子不同，cryo-ET通常在復雜的細胞環(huán)境內(nèi)對分子進行原位成像；cryo-EM一般獲得單張分子圖像，而cryo-ET一般獲得不同角度的圖像序列，這些圖像序列可以通過分析獲得三維的分子結(jié)構(gòu)。因此，cryo-EM的研究對象一般在組成和構(gòu)象變化方面相對簡單，而cryo-ET的研究對象相對來說會有更高階的組裝模式。
接下來，作者提到，近年來冷凍電鏡的技術(shù)發(fā)展主要體現(xiàn)在探測器的發(fā)展、樣品處理和新型軟件平臺的開發(fā)：(1) 直接電子探測器 (DED, direct electron detector) 的發(fā)展極大地提高了圖像的對比度和分辨率，(2) 聚焦離子束切割 (FIB, focused ion beam) 的應用與傳統(tǒng)冷凍切片相比，大大減少了對樣品的干擾，(3) 新型軟件平臺的創(chuàng)新進一步促進了cryo-EM的精確數(shù)據(jù)分析。
隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，目前冷凍電鏡可以處理的樣品也逐漸復雜化。相比于傳統(tǒng)的X射線晶體衍射常用的過表達蛋白后再純化相比，由于冷凍電鏡需要的樣品量較少，人們可以直接利用CRISPR技術(shù)將內(nèi)源蛋白連上標簽后直接純化內(nèi)源蛋白，這樣可以保證最后分析的蛋白最接近體內(nèi)的真實狀態(tài)。而對于復雜的蛋白復合物，則需要利用cryo-ET并且結(jié)合一系列計算程序來盡可能確保結(jié)構(gòu)的可信度。另一方面，人們也在放寬對蛋白提取的純度要求，而轉(zhuǎn)向?qū)毎呀馕锏却痔針悠愤M行粗略的結(jié)構(gòu)分析，這種方法可以有助于復雜混合物的初始模型構(gòu)建。除了對樣品進行體外分析之外，直接研究細胞樣品可以提供更偏向真實生理的信息。冷凍電鏡已經(jīng)在細胞切片 (FIB) 中有顯著的進展，如果研究者想觀察整個細胞或組織的話，將FIB切割和掃描電子顯微鏡 (FIB-SEM) 結(jié)合起來，再通過圖像處理可以獲得保真的超分辨電鏡細胞圖像。
當研究者獲得復雜的細胞圖像后，他們需要對細胞內(nèi)的分子進行辨別和區(qū)分。通常有兩種方法可以被用來定性這些分子：(1) 光電聯(lián)合顯微鏡 (CLEM, correlated light and electron microscopy)，通過對目標分子連上熒光分子來區(qū)分目標分子和其他結(jié)構(gòu)；(2) 利用分子標簽來直接指示目標分子的位置，可以是電子顆粒密度的差別也可以是目標分子的特殊結(jié)構(gòu)。當然，為了獲得更保真的超微結(jié)構(gòu)，以上這些都離不開更細致的數(shù)據(jù)分析手段。
Fig 1. 用cryo-ET可視化細胞結(jié)構(gòu)。
最后，作者介紹了cryo-EM和cryo-ET的結(jié)合應用。由于cryo-ET的結(jié)構(gòu)分辨率通常低于cryo-EM, 而cryo-ET可以對接近生理狀態(tài)下的細胞或組織成像，這兩種方法的互相補充可以用于解釋和補充低分辨率的cryo-ET圖像。例如，當cryo-ET獲得的細胞圖像尚未達到足以讓系統(tǒng)預測其中復合物的程度時，cryo-EM獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)模版可以幫助cryo-ET在原位細胞中辨別目標復合物。辨別的方法有兩種：(1) 在cryo-ET獲得的3D結(jié)構(gòu)中直接進行模版匹配，但由于cryo-ET的分辨率限制，人們也可以 (2) 眾多切片中的單個高分辨率圖像中進行2D模版匹配。但在更多情況下，這兩種方法會同時進行，相輔相成以確保預測的準確度。另外，cryo-ET也可以與細胞的熒光成像甚至是單細胞組學數(shù)據(jù)結(jié)合，為細胞調(diào)控提供全新的機制性理解。
提到近來的結(jié)構(gòu)生物學發(fā)展，便不可不提蛋白結(jié)構(gòu)預測領(lǐng)域中人工智能 (如AlphaFold或RosettaFold) 的廣泛應用。盡管可能有人擔心實驗性結(jié)構(gòu)生物學可能將被人工智能代替，但作者表示人工智能預測蛋白結(jié)構(gòu)可以是實驗性結(jié)構(gòu)生物學的強大助力。將人工智能的預測與cryo-EM或cryo-ET獲得的電子密度圖結(jié)合，這樣的實驗流程將會顯著加速結(jié)構(gòu)模型的建立，并使得解釋捕獲的真實細胞內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)的過程更加便捷。
總而言之，細胞生物學和結(jié)構(gòu)生物學的互補是人們理解細胞世界不可或缺的途徑，而冷凍電鏡的發(fā)展將會使人們對真實細胞活動的理解上升到另一個超微尺度。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07198-2
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